細(xì)胞在正常狀態(tài)下如何工作?當(dāng)它們引起疾病時(shí)，它們會(huì)如何變化?他們對(duì)新藥的反應(yīng)是否符合預(yù)期?如今，任何在實(shí)驗(yàn)室中尋求這些以及其他相關(guān)問(wèn)題的答案的人都離不開(kāi)一種特殊的技術(shù)：?jiǎn)渭?xì)胞RNA測(cè)序，簡(jiǎn)稱“scRNA-seq”。該技術(shù)提供了特定時(shí)間點(diǎn)單個(gè)細(xì)胞中基因表達(dá)的準(zhǔn)確圖像以及相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而可以得出有關(guān)細(xì)胞活性的分子基礎(chǔ)的結(jié)論。

維爾茨堡朱利葉斯-馬克西米利安大學(xué)(JMU)的一個(gè)研究小組現(xiàn)在進(jìn)一步改進(jìn)了以前開(kāi)發(fā)的用于細(xì)菌的單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)。這意味著實(shí)驗(yàn)室的工作比以前更快，并提供更精確的信息。該團(tuán)隊(duì)在mBio雜志上介紹了其發(fā)展。

通過(guò)自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)高通量

現(xiàn)在發(fā)表的這項(xiàng)研究的領(lǐng)導(dǎo)者是Jörg Vogel教授。Vogel是JMU分子感染生物學(xué)研究所(IMIB)的負(fù)責(zé)人，也是亥姆霍茲基于RNA的感染研究所(HIRI)的主任。他是RNA研究領(lǐng)域的世界領(lǐng)先專家之一。

“通過(guò)集成用戶友好且高度靈活的自動(dòng)化過(guò)程，我們實(shí)現(xiàn)了更高的細(xì)胞通量，”Vogel說(shuō)，描述了現(xiàn)在介紹的方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。此外，該技術(shù)工作更穩(wěn)健，降低了讀取遺傳信息的失敗率，并以更低的測(cè)序成本提供了有關(guān)單個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)的更多信息。

平均值隱藏重要細(xì)節(jié)

直到幾年前，對(duì)細(xì)菌轉(zhuǎn)錄組(給定時(shí)間細(xì)胞中所有活躍基因的集合)的研究依賴于批量RNA測(cè)序(RNA-seq)。“然而，這種方法僅提供細(xì)胞群的平均值，因此無(wú)法就該群體中單個(gè)細(xì)菌之間的可能差異得出任何結(jié)論，”Vogel解釋說(shuō)。

然而，這種差異 - 在這種情況下，科學(xué)家將它們稱為“表型異質(zhì)性” - 通常在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)。它們使它們能夠快速適應(yīng)不斷變化的環(huán)境，因此在細(xì)菌生存策略中發(fā)揮重要作用。

細(xì)菌對(duì)技術(shù)構(gòu)成特殊挑戰(zhàn)

雖然2009年為真核生物(具有細(xì)胞核的細(xì)胞)引入了單細(xì)胞RNA測(cè)序，但這種細(xì)菌技術(shù)的發(fā)展要慢得多。許多挑戰(zhàn)是造成這種情況的原因：“與真核生物相比，原核細(xì)胞要小得多，這意味著每個(gè)細(xì)胞需要研究的材料要少得多，”Vogel解釋說(shuō)。其他問(wèn)題包括分解細(xì)胞壁(稱為細(xì)胞裂解)和檢測(cè)特定的細(xì)菌轉(zhuǎn)錄物。

的確，由于技術(shù)進(jìn)步，細(xì)菌單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)最近也已成為現(xiàn)實(shí)。然而，仍有改進(jìn)的余地，例如，因?yàn)榧?xì)胞丟失的頻率太高或短轉(zhuǎn)錄本(如調(diào)節(jié)性小RNA(sRNA))檢測(cè)不佳或根本無(wú)法測(cè)量。“此外，轉(zhuǎn)錄本識(shí)別目前僅限于每個(gè)細(xì)胞約200個(gè)基因，遠(yuǎn)低于平均細(xì)菌轉(zhuǎn)錄組，”Vogel解釋說(shuō)。

成功驗(yàn)證沙門氏菌

其中一些問(wèn)題可以通過(guò)現(xiàn)在提出的scRNA測(cè)序技術(shù)的改進(jìn)來(lái)解決，正如研究小組能夠通過(guò)研究不同生長(zhǎng)條件下的沙門氏菌類型細(xì)菌所證明的那樣。數(shù)據(jù)顯示，實(shí)施的更改提高了細(xì)胞通量和協(xié)議的穩(wěn)健性，同時(shí)減少了細(xì)胞損失。

此外，科學(xué)家們還能夠提高基因覆蓋率和基因檢測(cè)限。“我們甚至能夠在單細(xì)胞水平上檢測(cè)sRNA，這在以前是不可能的，”Vogel說(shuō)。他補(bǔ)充說(shuō)，這將允許在未來(lái)的研究中探索單細(xì)胞水平上sRNA的調(diào)節(jié)功能。

此外，數(shù)據(jù)證實(shí)了同一細(xì)胞群內(nèi)的異質(zhì)性，這無(wú)法從先前測(cè)序技術(shù)的平均值中讀取。例如，它們現(xiàn)在提供有關(guān)基因活性的信息，這些基因?qū)@些細(xì)菌的致病特性特別重要。

這使得該方法特別適用于起始材料有限的實(shí)驗(yàn)，例如用于分析宿主生態(tài)位中細(xì)菌細(xì)胞的小亞群或細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。